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Ⅰ. El principio de la tecnología PCR

Este año, el COVID-19 se está librando en todo el mundo, y todos deben haber oído hablar de las pruebas de ácido nucleico. En la detección de ácidos nucleicos de la epidemia, la tecnología de fluorescencia de PCR juega un papel central, que puede ayudar a los inspectores a determinar de forma rápida y precisa si están infectados con la COVID-19.

¿Qué es exactamente la tecnología PCR?

PCR es un acrónimo de reacción en cadena de la polimerasa. En resumen, la PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización a alta temperatura-recocido a baja temperatura-extensión a temperatura media:

1. desnaturalización del ADN para convertirse en una sola hebra

Después de calentar el ADN molde a aproximadamente 95 °C durante un cierto período de tiempo, la doble cadena del ADN molde se disocia en una sola cadena de modo que pueda unirse al cebador y prepararse para la siguiente ronda de reacción.

2. recocido de baja temperatura

Después de que el ADN molde se desnaturaliza en cadenas sencillas, la temperatura se reduce a aproximadamente 55 °C, y los cebadores se emparejan con las secuencias complementarias de las cadenas sencillas de ADN molde.

Extensión de la temperatura 3. Medium

Bajo la acción de la enzima Taq, la plantilla de ADN y los conjugados de cebador utilizan dNTP como materia prima de reacción y la secuencia diana como plantilla, de acuerdo con el principio de emparejamiento de bases y replicación semi-reservada, y finalmente sintetizan una nueva cadena de replicación semi-reservada complementaria a la cadena de ADN de plantilla.

Ⅱ. Métodos de detección de PCR fluorescente

En la actualidad, la mayoría de los reactivos de detección de COVID-19 aprobados por la Administración Estatal de Medicamentos de China utilizan métodos de PCR fluorescente para detectar la COVID-19.

El método de PCR fluorescente se refiere a la adición de grupos fluorescentes al sistema de reacción de PCR. Con el progreso de la amplificación por PCR, los productos de reacción continúan acumulándose, y la intensidad de la señal de fluorescencia también aumenta proporcionalmente. Gráfico de la curva de amplificación de fluorescencia, detección en tiempo real del proceso de fluorescencia de PCR.

Ⅲ. Principios de selección de consumibles fluorescentes de PCR

1. Material

La PCR generalmente está hecha de material de PP, porque los consumibles de PCR/qPCR generalmente están en contacto directo con reactivos o muestras, mientras que el material de polipropileno (PP) es un material biológicamente inerte, la superficie no es fácil de adherir a las biomoléculas y tiene buena resistencia química y temperatura. Tolerancia (puede ser esterilizado en el autoclave en 121 °C y puede también soportar cambios de temperatura durante el ciclo termal). Los consumibles de PCR son todos material PP.

2. tubo de PCR/volumen de la placa

¿Cómo elegir tubos/placas de PCR de diferentes volúmenes?

Propósito de la selección: seleccione el producto apropiado según los requisitos experimentales específicos. El volumen de tubos de PCR puede cumplir principalmente los requisitos de las reacciones de PCR. Los tubos de PCR son ideales para experimentos de PCR/qPCR de rendimiento bajo a medio, siendo los dos formatos más utilizados los tubos y tiras individuales.

Un solo tubo proporciona la flexibilidad para establecer el número exacto de reacciones a ejecutar. Alternativamente, puede seleccionarse un único tubo de 0,5 ml para volúmenes de reacción mayores.

Los acoplamientos generalmente están disponibles en formato de 8 o 12 tubos con tapas separadas o con tapas. Compatible con pipetas monocanal y multicanal para experimentos de bajo y medio rendimiento. Las tiras con los casquillos abren y cierran los tubos de la muestra independientemente para prevenir la contaminación de la muestra.

3. espesor de la pared

El grosor de la pared del tubo afecta directamente la conductividad térmica, y los espesores de pared extremadamente delgados optimizan la transferencia de calor y reducen el tiempo de ciclo. El plástico de pared ultrafina es aproximadamente un 50% más delgado que la versión estándar, lo que reduce aún más la barrera térmica, lo que resulta en una respuesta más rápida y robusta. Los consumibles de PCR son todas paredes de tubos ultrafinos.

4. Color

Las placas de PCR a menudo están disponibles en una variedad de diferentes formatos de color para facilitar la diferenciación visual y la identificación de muestras, especialmente en experimentos de alto rendimiento. Para reacciones de PCR ordinarias, es posible usar tubos de PCR transparentes o coloreados, y los tubos de PCR transparentes son más útiles para la gestión de clasificación de muestras.

Aunque el color del plástico no tiene efecto sobre la amplificación del ADN, se recomiendan consumibles de PCR blancos de alta calidad para qPCR. Dado que la qPCR requiere la detección cuantitativa en tiempo real de la intensidad de la señal de fluorescencia, se requiere una transmisión de señal de fluorescencia sensible y precisa. Los experimentos han demostrado que, en comparación con los productos de PCR transparentes tradicionales, los productos de PCR blancos pueden reflejar la señal fluorescente en la mayor medida, reducir la contaminación cruzada de las señales espaciales y obtener los resultados de la PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real.

Diferentes marcas de instrumentos, debido al diseño de posición diferente del detector de fluorescencia, consulte los materiales recomendados por el fabricante. Para el instrumento de PCR en tiempo real Bio-Rad CFX o Roche 480, el fabricante recomienda el uso de placas blancas de PCR. Debido a que la placa de PCR es blanca o transparente, y tiene varias especificaciones, es adecuada para instrumentos de PCR comunes en el mercado.