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1. PCR cuantitativa en tiempo real

En 1996, Applied Biosystems introdujo por primera vez la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (PCR en tiempo real) en los Estados Unidos. La denominada qPCR en tiempo real se refiere a la adición de grupos fluorescentes a la reacción de PCR para monitorizar continuamente la señal fluorescente. El orden de aparición y el cambio de intensidad de la señal pueden usarse para analizar la cantidad inicial del gen diana en tiempo real. La invención de esta tecnología realiza el salto de PCR cualitativa a cuantitativa.

2. productos químicos utilizados en la fluorescencia de PCR

En la actualidad, la qPCR en tiempo real se divide en dos categorías: colorantes fluorescentes y sondas fluorescentes según los diferentes productos químicos fluorescentes utilizados.

3. tintes utilizados en la fluorescencia de PCR

Los colorantes fluorescentes también se denominan colorantes de unión al ADN. La principal molécula colorante usada actualmente es SYBR Green I. SYBR Green I puede unirse específicamente al surco menor del ADN bicatenario. SYBR Green I libre casi no tiene señal fluorescente, pero se une al ADN bicatenario. Después de eso, su señal de fluorescencia puede aumentarse cientos de veces. Con el aumento del producto de PCR, la cantidad de unión del producto de PCR y el colorante también aumenta, y la intensidad de la señal de fluorescencia representa el número de moléculas de ADN de doble cadena.

Las ventajas de los colorantes fluorescentes son que son fáciles de usar, se pueden combinar con cualquier producto de PCR y son económicos.

En general, el método SYBR Green I es uno de los experimentos de qPCR en tiempo real más básicos y comúnmente utilizados.

4. sondas para fluorescencia PCR

The most commonly used fluorescent probes in Real-time qPCR are TaqMan probes. The basic principle is to design and synthesize a probe that can specifically hybridize to the target gene. The 5' end of the probe is labeled with a fluorophore, and the 3' end is labeled with a quencher group.

En circunstancias normales, la distancia espacial entre los dos grupos es muy cercana, y el gen fluorescente no puede fluorescer debido a la extinción. Durante la amplificación por PCR, el cebador y la sonda se unen al molde al mismo tiempo, y la posición de unión de la sonda se localiza entre los cebadores aguas arriba y aguas abajo.

When the amplification extends to the position where the probe binds, the Taq enzyme uses the 5' exonuclease activity to cleave the fluorescent molecule attached to the 5' end of the probe from the probe, causing it to fluoresce. The number of detected fluorescent molecules is proportional to the number of PCR products, therefore, the number of initial DNA templates can be calculated according to the fluorescence intensity in the PCR reaction system.

La tecnología de sonda TaqMan resuelve el problema de la combinación de colorantes fluorescentes y amplificación no específica. Después de la reacción, no hay necesidad de detección de curva de fusión, lo que acorta el tiempo de prueba.

Las ventajas de la tecnología de sonda TaqMan son un fondo de baja fluorescencia, alta sensibilidad, alta estabilidad de hibridación, buena resolución espectral de fluorescencia y alta especificidad.

Debido a la alta especificidad de las sondas TaqMan, puede usarse para discriminación alélica, especialmente para polimorfismos de genes humanos y para distinguir y cuantificar cepas basadas en SNP.